熱応答性 C22 ファージの剛性がファージの感染力を調節する

Nov 27, 2023

Scientific Reports volume 12、記事番号: 13001 (2022) この記事を引用

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メトリクスの詳細

バクテリオファージは、作物の病気を制御するための持続可能な代替手段を提供します。しかし、ファージの感染メカニズムに関する知識が不足しているため、ファージに基づく生物学的制御は変化に富み、効果がありません。この研究では、感染の温度依存性と C22 ファージの熱応答性挙動を調査しました。この土壌伝染性ポドウイルスは、Ralstonia solanacearum を溶解し、青枯病を引き起こす可能性があります。我々は、C22 ファージが高温 (35、40 °C) よりも低温 (25、30 °C) でインキュベートした場合の方が病原性宿主細胞によく感染できることを明らかにしました。 C22 ファージの剛性を測定したところ、低温時のファージの剛性は高温時の 2 ～ 3 倍であることが明らかになりました。さらに、イメージング結果は、高温よりも低温でより多くの C22 ファージ粒子が細胞表面に付着し、ファージの剛性とファージの付着に関連していることを示しました。この結果は、温度変化に応じた構造と剛性の調節が感染を改善することを示唆しており、C22 ファージの溶解サイクルについての機構的な洞察が得られます。私たちの研究は、効果的なファージベースの生物的防除の実施のために、変動する環境に対するファージの反応を理解する必要性を示しています。

Ralstonia solanacearum によって引き起こされる青枯病は、ジャガイモ、トマト、タバコ、唐辛子などの経済作物に被害を与え、年間約 10 億米ドルの損害を与えています1。土壌消毒、土壌改良、輪作などの従来の手法は、病原菌が土壌中で長期間生存し、水路を介して近隣地域に伝播する能力があるため、労働集約的かつ非効率的です2、3。細菌を除去するために化学物質や殺虫剤を使用すると、消耗品、人間の健康、環境に有害な残留物が生じます。したがって、拮抗剤を使用した萎凋病を引き起こす Ralstonia solanacearum の生物学的防除は、安全な代替手段として関心を集めています 4,5。そのような薬剤の中で、溶解性バクテリオファージまたはファージは、そのような損傷を与える細菌の制御において有望な結果を示しています6、7、8、9。ファージは特定の宿主細菌細胞を標的とします。すべての宿主細胞が根絶されると、ファージは複製されなくなります。ファージは一般に安全（GRAS）であり、真核生物に対して無毒であると認識されており、青枯病を含む作物の病気を予防および治療するための魅力的な選択肢となっています 10,11。

ファージの利点にもかかわらず、ファージを介した生物的防除は、その有効性が変動するため十分に活用されていません12、13、14、15。ファージの生物的制御の成功は、ファージによる細菌宿主細胞の感染に依存します。ファージは、pH、イオン、浸透圧などのいくつかの周囲の要因によって支配されます16、17、18。すべての微小環境に影響を与える要因は温度です。生物的防除に使用されるファージは、毎日の気候や農地の季節変動により、温度の変動を常に経験します。ファージの温度依存性は以前に研究されています。ただし、ファージ感染に対する温度の正確な役割は不明のままです。一部のファージは、特定の許容温度でよりよく感染することができます19、20、21、22。大腸菌に感染するラムダファージとバークホルデリア・シュードマリーに感染するファージは、約20～35℃よりも約35～40℃の方が宿主細胞に効率的に感染し、より多くの子孫ファージを産生した20,22。 ɸS1 ファージによるシュードモナス・フルオレセンスの細胞溶解研究では、37 °C よりも 26 °C の方が感染率が高いことが示されました 23。一方で、一部のファージは温度に鈍感です。 T4 ミオウイルスファージは、15 ～ 41 °C の温度範囲内で効率的に大腸菌 BL21 を溶解しました 24。リステリアモノサイトゲネスに感染する P100 ファージは、4 ～ 60 ℃でも感染性を維持しました 25,26。 Pseudomonas syringae に感染して細菌性潰瘍を引き起こす MR5 ファージは、20、27、および 37 °C で同様の感染力を示しました27。温度がファージ感染にどのような影響を与えるかを理解することは、温度予測データおよび感染と組み合わせることで、ファージの生物的防除の使用に関するガイドラインを提供することができます6,28。したがって、私たちは生物防除におけるファージの温度の役割を解読しようと試みます。

ファージ感染に対する温度の影響は、ファージの構造成分が温度変化にどのように分子的に反応するかによって制御されます。リステリアモノサイトゲネスに感染した A511 ファージは、A511 ファージの尾部キャプシドコネクタータンパク質の融点がわずかに高いため、高温 (60 ～ 80 °C) で P100 ファージよりも安定でした 25。 T7 ファージに関する研究では、高温によりファージキャプシドからファージテールの切断が引き起こされるため、高温により宿主テールのファージ感染が減少することが示されました 29。いくつかの研究では、温度上昇によりゲノムを宿主細胞内に推進するためのより多くの熱エネルギーが提供されるため、感染が改善されることが示唆されています30、31、32。熱変化に応答したファージタンパク質および構造内の分子相互作用を理解すると、ファージの感染と生存の根本的なメカニズムが明らかになります。したがって、温度の影響を理解するには分子スケールでの洞察が必要であり、これによりファージを生物的防除剤として使用するためのオーダーメイドのガイドラインが提供されます。

この研究では、溶解性 C22 ファージとその感染における温度の役割を明らかにしました。タイの土壌サンプルから分離された C22 ポドウイルスは、病原性細菌 Ralstonia solanacearum (Rs) を溶解し、トマトやピーマンに青枯病を引き起こす可能性があります 33。この病気はジャガイモ、タバコ、ナスなどの他のナス科作物も枯らし、世界的に年間 10 億米ドルの損失をもたらします 34。したがって、C22 ファージは、青枯病に対して緊急に必要とされる有望な抗菌剤となる。我々は、プラークベースの感染力アッセイを使用して、C22 ファージに対する温度の影響を研究しました。 25 ～ 30 °C で加熱した C22 ファージは、35 ～ 40 °C でインキュベートした C22 ファージよりも約 44% 良く宿主細胞に感染できることがわかりました。原子間力顕微鏡 (AFM) ベースの技術を使用して、さまざまな温度でインキュベートした C22 ファージ粒子を検査することにより、温度の直接的な影響を調査しました。 AFMは、ナノメートルサイズの先端を備えたカンチレバーを利用して、滑らかな表面に弱く付着したファージ粒子を愛撫します。粒子の一部の詳細を妨げたり、粒子の特性に影響を与えたりする可能性のあるファージ粒子の化学修飾や染色は必要ありません 35、36、37。我々は、C22 ファージの画像をキャプチャし、さまざまな温度の液体環境中で AFM ベースのナノインデンテーションを使用してファージの剛性を測定しました。この結果は、ファージの剛性が宿主細胞表面へのファージの結合において重要な役割を果たしている可能性を示唆しています。ファージの剛性はファージ粒子の構造的完全性から現れるため、我々の結果は、ファージの構造と溶解サイクルにおける機能との間の熱応答性の関係を意味しており、実際のファージの使用のためにはこの関係を完全に理解する必要がある。

我々は、わずかに変更を加えたプラークベースの感染力アッセイ (プラークアッセイ) を使用して、C22 ファージの感染力に対する温度の影響を調べました 38。改良されたプラークアッセイでは、C22 ファージを 4 つの温度 (25、30、35、および 40 °C) で 30 分間インキュベートした後、Rs 細胞と混合し、CPG 培地寒天上でインキュベートしました。一晩インキュベートした後、ファージによる細菌細胞の溶解が成功したことを示すクリアゾーンまたはプラークの数を、力価と呼ばれるファージ体積あたりのプラーク形成単位（PFU/mL）として記録した。 25、30、35、および40℃でのファージ力価を収集し、25℃で記録された平均ファージ力価によって100%に正規化しました。私たちの研究の温度範囲は、C22 ファージがタイの農地で耐えなければならない温度変動をカバーしていました 39,40。

正規化された力価 (図 1) は、温度が上昇するにつれて全体的に減少する傾向を示しました。温度が 25 °C から 30 °C に上昇すると、力価は約 10% わずかに減少しました (補足表 S1 を参照)。温度が 30 °C から 35 °C に上昇すると、力価は約 44% 急速に減少しました。最後に、温度が 35 °C から 40 °C に上昇しても、力価は比較的同様のままでした。その結果、30 分間のインキュベーションにより C22 ファージサンプルに何らかの変化が生じ、感染力が変化したことが示されました。したがって、各温度でのインキュベーション中に C22 ファージがどのような影響を受けたかをさらに調査しました。

25、30、35、および40℃でのC22ファージの相対力価。力価測定は３回行い、エラーバーは標準偏差（sd）を表した。

C22 ファージの一部の特性は、インキュベーション期間中に熱的に変化または誘導され、力価の低下を引き起こす可能性があります。したがって、MES 緩衝環境で AFM ベースの技術を使用して、25、30、35、および 40 °C で C22 ファージ粒子を調査しました。 AFM は 16 µm2 の領域を捕捉し、そこには 10 個を超えるファージ粒子が含まれていました。ファージ粒子を計数し、次のように分類しました。個々に分離された粒子は「分散」カテゴリーに数えられました。 2 つ以上の付着した粒子の集合は「凝集」カテゴリでカウントされました。各カテゴリの数は、各温度で少なくとも 1000 個の粒子である合計粒子数に正規化されました (補足図 S1)。 4 つの温度での C22 ファージ粒子の AFM 画像は、ほとんどの C22 ファージ粒子 (> 90%) が分散し、粒子のごく一部 (< 10%) のみが凝集していることを示しました (補足図 S2; 表 S2)。

凝集したファージ粒子は、運動の程度が低いため、分散した粒子よりも宿主細胞に衝突して付着する確率が低くなります。その結果、ファージの凝集により宿主細胞の感染が減少する可能性があります41、42。 AFM 画像の分析により、ファージ粒子の大部分が分散していることが示されました。この結果は、各温度でインキュベートしたほとんどの C22 ファージ粒子が宿主細胞と結合して相互作用できることを意味します。 4 つの温度における C22 ファージの分散と凝集は、定量的に同様でした。したがって、プラークアッセイで観察された凝集による感染力の低下は考えられません。感染の減少は、個々のファージ粒子の特性の変化によって引き起こされる可能性があります。

25、30、35、および40℃のMESバッファー中のC22ファージ粒子の構造を、AFM非接触イメージング法によって捕捉および分析しました。 AFM データと分析により、C22 ファージ粒子は無傷のままであり、4 つの温度において形態学的に類似していることが実証されました。 25℃のMES緩衝液中のC22ファージの例示的なAFM画像(図2a)は、直径約40nmの正二十面体形状を示した(図2b)。小さなファージ粒子で観察された角度の特徴は、C22 ファージで顕著になりました 43,44。 4つの温度でファージ構造を詳しく観察したところ、ファージ粒子の構造的損傷や崩壊は観察されませんでした（補足図S3）。 C22 ファージ粒子の平均直径は 4 つの温度でほぼ同じでした (図 2c; 補足表 S3)。これは、C22 ファージ粒子の収縮または膨張がないことを示唆しています。したがって、ファージ粒子の構造的損傷や不安定性は感染力低下の原因ではありません。

AFMで調べたC22ファージ粒子のサイズ。 (a) 25 °C の MES バッファー中の C22 ファージ粒子の AFM 画像。カラーグラデーションスケールバーは高さ(Z方向)を示しました。オレンジ色の挿入図は、正二十面体形状を示しています。 (b) 粒子直径は粒子の断面 (白い破線) から抽出されました。 (c) 25、30、35、および 40 °C での C22 ファージ粒子の平均直径は約 40 nm でした。エラーバーは、50 個の粒子の標準偏差 (sd) を表しました。

C22 ファージ粒子は形態学的に類似していましたが、ファージ粒子の他の構造特性は 25 ～ 40 °C 以内で変化する可能性があります。そこで、ファージ粒子の動的変化を調べるために、ナノインデンテーションと呼ばれる別の AFM ベースのアプローチを採用しました。このアプローチでは、粒子をへこませて、剛性や破壊力などのファージの機械的特性を測定しました。このような特性は、ゲノムパッケージング 45,46、ゲノム転移 47,48、キャプシド安定性 29,49 など、ウイルスのライフサイクルにおける重要なステップに関連しています。この研究では、25、30、35、および40℃でのMESバッファー中のC22ファージ粒子の剛性が抽出され、ファージ粒子と雲母の力-距離曲線から計算されました（補足図S4）。 25、30、35、および 40 °C でのファージの剛性の分布は、各温度で 50 ～ 60 のファージの剛性値から生成されました。分布を正規分布に当てはめて、C22 ファージの代表的な剛性を抽出しました (図 3)。 C22 ファージの剛性は、温度が上昇するにつれて低下する傾向を示しました (図 4)。 30 °C でのファージの剛性 (0.065 ± 0.01 N/m) は、25 °C (0.071 ± 0.01 N/m) よりもわずかに低かった。ファージの剛性は 35 °C で約 55% 減少しました (0.029 ± 0.01 N/m)。ファージの剛性は 40 °C で比較的影響を受けませんでした (0.028 ± 0.01 N/m)。我々は、剛性の低下は、修正プラークアッセイによって観察された C22 ファージの感染の減少に関連しているのではないかという仮説を立てました。

25 (a)、30 (b)、35 (c)、および 40 °C (d) での MES バッファー中の C22 ファージの剛性分布のプロット。灰色の破線は正規分布フィッティングであり、中心（灰色の矢印）は各温度でのファージの剛性を表します。

C22 ファージの剛性は、温度が 25 °C から 40 °C に上昇するにつれて減少しました。エラーバーは標準偏差 (sd) を表しました。

明らかな疑問が残ります:ファージの剛性の低下が感染力の低下にどのように寄与するのでしょうか? この疑問に答えるために、我々は、さまざまな温度で C22 ファージが宿主細胞とどのように相互作用するかを調査しました。各温度で 30 分間インキュベートした後、C22 ファージを、プラーク感染性研究と同じ感染多重度で宿主細胞と混合しました。混合物を AFM イメージングで調査しました。

Rs細胞のサイズ（図5a）は、長さが約1.8μm、幅が0.9μmであると測定されました。 C22ファージと細胞の混合物を研究したところ、細胞表面に結合したファージ粒子が区別して観察できることがわかりました（図5b、e挿入図）。細胞表面上の C22 ファージの結合は、潜在的な受容体が細胞表面に存在することを示唆しています。候補となる受容体は、膜貫通タンパク質または細胞表面から突き出た分子（リポ多糖など）です 31,50。また、細胞表面に付着している C22 ファージ粒子の数が異なることもわかりました。 25℃および30℃では、多くのC22ファージ粒子が細胞表面に結合しました（図5b、c）が、35℃および40℃では、少数のC22ファージ粒子のみが細胞表面に結合しました（図5d、 e)。宿主細胞に付着したファージ粒子が多いほど、細胞がファージに感染する可能性が高いことを意味します。データは、25 ℃ および 30 ℃ でインキュベートした C22 ファージが、35 ℃ および 40 ℃ よりも効果的に宿主細胞に感染できることを示しています。このデータは、25 °C および 30 °C で感染が改善されたことを示すプラークアッセイの結果とも一致しています。ファージの剛性の結果と組み合わせると、25 °C および 30 °C の比較的硬い C22 ファージ粒子は、35 °C および 40 °C の比較的柔らかい C22 ファージ粒子よりも細胞表面に結合し、宿主細胞によく感染する可能性があると考えられます。

異なる温度におけるC22ファージおよびRs細胞の例示的なAFM画像。 (a) C22 ファージを含まない Rs 細胞の AFM 画像。 Rs細胞と混合して25℃（b）、30℃（c）、35℃（d）、および40℃（e）でインキュベートしたC22ファージをAFMによって調査した。個々の C22 ファージ粒子は (b、e) 挿入図で区別できます。カラーグラデーションスケールバーは、垂直振幅 (Z 方向) のスケールでした。 (a〜e) パネルの白いスケールバーは 500 nm、挿入図の白いスケールバーは 100 nm でした。

この研究では、C22 ファージを 25 °C から 40 °C まで上昇させながらインキュベートすると、C22 ファージによる Rs 細胞の感染が減少することがわかりました。温度はこの温度範囲内で C22 ファージ粒子に何らかの変化を引き起こし、その結果感染力が低下するはずです。検査したところ、ファージ粒子は主に凝集しておらず、感染減少の原因と思われる凝集は排除されました。個々のファージ粒子をさらに調査したところ、温度を上昇させても粒子が形態学的変化を示さないことが明らかになりました。ただし、粒子の剛性は低下しました。熱エネルギーの増加により、キャプシドタンパク質と DNA の局所振動が強化され、キャプソメアと二本鎖 (ds) DNA 鎖間の引力相互作用が弱まり、剛性が低下する可能性があります 51。以前の計算研究では、ウイルスのカプシドが温度の上昇とともに「流動性」転移を起こす可能性があることが示唆されています52。この移行下では、キャプソメア間の平均分離が特定の閾値を超え、キャプシドの柔軟性が高まり、剛性が低くなります。高密度に充填された dsDNA の剛性の低下は、ウイルスカプシド内の dsDNA の固体から液体への移行によるファージの剛性の低下にも関与している可能性があります 32,48。温度が上昇すると、DNA 構造はさらに乱れ、剛性が低下しました。全体として、C22 ファージキャプシドと内部 dsDNA はおそらく同様の遷移を経験し、剛性の低下に寄与していると考えられます。

我々は、剛性の低下がRs細胞の感染を調節していると推測した。剛性の低下が細胞膜に付着したファージ粒子の数の減少と関連しているという発見は、私たちの仮説を強化しました。換言すれば、熱によって誘導されたC22ファージ粒子の剛性の減少は結合効率を妨げ、したがってC22ファージによる宿主細胞の感染を減少させる。この発見は、感染サイクルにおけるファージ結合におけるファージの剛性の役割を調査することを我々に促しています。ファージ吸着の古典的なモデルでは、ファージの尾部繊維またはスパイクと宿主細胞の受容体との間の認識によって結合が開始されることが示されています53,54。ファージの剛性は主に、カプシドタンパク質と内部に詰まった dsDNA から生じます。その豊富さにより 32、45、55、56 です。したがって、ファージの剛性の影響は、キャプシドタンパク質および DNA に由来し、ファイバーおよびスパイクタンパク質に伝播する可能性があります。我々は、門脈タンパク質がこの提案されたメカニズムの伝播を実行する可能性があると仮説を立てています57,58。キャプシド DNA アンサンブルと尾部タンパク質を接続するこの動的構造は、柔軟性があり、全体的な構造変化を検出する機械センサーのように動作することが示されています 59,60。ファージ粒子の剛性が高いほど、キャプシド構造がよりコンパクトになり、DNA61 が密に詰まっていることが推測されます。このような構造は分子間距離が小さく、剛性の低いファージ粒子よりも機械的に構造変化をよりよく伝播する可能性があります。例えば、結合中の尾部繊維またはスパイクの動きを促進することができる。 DNA の排出は、剛性の低いファージ粒子よりも剛性の高いファージ粒子の方が、ポータルタンパク質の伸長または圧縮の伝播によって促進されます 62,63。分子レベルでの正確なメカニズムにはさらなる構造研究が必要であり、今後の研究で追求される予定です。

さらに、温度は追加のメカニズムを通じてファージの感染性に影響を与える可能性があります。温度は構造変化を誘発したり、繊維に損傷を与えたり、スパイクタンパク質の特性（柔軟性など）やウイルス結合に影響を与えたりする可能性があります19,64。温度はまた、ファージ粒子の確率的運動を増加させ、ファージ結合タンパク質と宿主細胞受容体との間の結合および放出事象に影響を与える可能性がある65、66。温度は、感染プロセスに関与する遺伝子またはタンパク質の発現に影響を与える可能性があります67,68。ただし、ファージと宿主の相互作用は一時的な性質があるため、構造成分に対する温度の影響の程度は不明です。

我々の最近の研究では、C22 ファージの剛性は異なる pH とイオン強度によって変化しましたが、吸着効率は比較的一定のままでした 35。この研究の AFM 結果は、そうでないことを明らかにしました。温度が上昇すると、吸着ステップにおける C22 ファージ粒子の数が減少しました。これは、C22 ファージ粒子の剛性の低下に関係している可能性があります。この不一致は、ファージの吸着を調査するために使用される方法に起因すると考えられます。以前の研究は、ファージ吸着細胞の沈殿後の上清中の未吸着のファージ粒子の量に依存していました。この実験的アプローチでは、細胞表面へのファージ粒子の吸着を直接調査しませんでした。この研究では、宿主細胞上の C22 ファージ結合を直接視覚化し、より高い解像度と精度で in situ 結合イベントの実際のビューを提供します。

ウイルスの硬さのダイナミクスは、感染の可能性を最大化するためのウイルス粒子の分子調整によって生じます。剛性の調節はウイルスの種類、ひいては応答性の構造成分に依存すると考えられます。私たちの以前の研究では、C22 ファージの高い感染力がその中間の硬さと関連していることが示されました 35。マウスの微小ウイルスは、キャプシド上のカプソメアおよびカプソメア尾部のポータル結合を弛緩させ、機械的硬化を低下させ、感染を改善した69。ラムダファージと単純ヘルペスウイルス 1 型は、DNA の剛性を低下させることにより、宿主細胞への DNA 転移を促進しました 32,48,70,71。ヒト免疫不全ウイルスは、成熟によって膜の剛性を低下させ、細胞侵入を改善しました 72。したがって、剛性の調節は、ウイルスが生存と複製を調整するためのフィードバックメカニズムであると考えることができます。

我々の結果は、ファージの溶解サイクルの熱応答性の構造的およびナノメカニカルな側面を意味しており、作物の病気管理における実際のファージの使用のためには、これを完全に理解する必要がある。 C22 ファージの感染を理解することで、生物防除用途において温度が変動する野外で C22 ファージを効果的に使用する方法を考案できるようになります。たとえば、温度が 35 ～ 40 °C に達すると C22 ファージの感染力が低下する可能性があるため、農家は気温が低い時期 (25 ～ 30 °C) に C22 ファージを使用する必要があります。この研究で得られた知識と、土壌温度センサーやIoTなどの精密農業技術の利用可能性は、農家が環境の状態を監視し、ファージの生物的防除を適切に管理するのに役立ちます28,73。

Ralstonia solanacearum 株 RS3/1-1 (レース 1 バイオバール 4) を 28 °C、230 rpm 振盪で一晩培養したものを、0.1% (w/v) カザミノ酸、1% ( w/v) ペプトン、および 0.5% (w/v) グルコース。 C22 ファージの精製は他の場所で説明されています 35。 C22 ファージペレットを、0.05 M 2-(N-モルホリノ) エタンスルホン酸または MES (Sigma-Aldrich) pH 6.0、0.1 M NaCl、および 0.05 M MgSO4 からなる MES 緩衝液に再懸濁し、4℃で保存しました 35,74。

Ｒｓ株ＲＳ３／１－１を２８℃、２３０ｒｐｍで振盪しながら一晩培養したものを、新鮮なＣＰＧ培地でＯＤ６００が０．２５になるまで希釈した。最初のケース (インキュベートされたファージ) では、MES バッファー中の C22 ファージ 100 μL を各温度 (25、30、35、40 °C) で 30 分間インキュベートしました。その後、インキュベートしたファージ懸濁液10μLを、希釈したRs培養液250μLと混合した。 30分間のインキュベーション後、混合物にCPG培地中の融解した0.45%寒天を加え、1.5%寒天を含むCPGプレート上に重層した。 28℃で一晩インキュベートした後、プラークの数を記録しました。プラークアッセイは３回実施した。

マイカ (V1 グレード、テッドペラ) を 2 つの化学薬品で別々にコーティングしました。最初の化学物質はポリ-L-リジン (PLL) 溶液 (Sigma-Aldrich) でした。雲母を切断し、0.1% (w/v) PLL 溶液中で 15 分間インキュベートしました。雲母を脱イオン水ですすぎ、窒素ガスで乾燥させた。 PLL でコーティングされた雲母を使用して Rs 細胞を固定しました。 2 番目の化学物質は、(3-アミノプロピル) トリエトキシシラン (APTS) (Sigma-Aldrich) でした。雲母を切断し、1% APTS 脱イオン水溶液中で 50 rpm で振盪しながら 15 分間インキュベートしました。雲母を脱イオン水ですすぎ、窒素ガスで乾燥させた。 APTS でコーティングされた雲母を使用して、C22 ファージ粒子を固定化しました。

Rs 細胞 AFM イメージングでは、C22 ファージを各温度 (25、30、35、40 °C) で 30 分間インキュベートしました。次いで、インキュベートしたファージをRs細胞と30分間混合し、続いてPLLでコーティングした雲母上で室温で30分間インキュベートした。その後、雲母基板上に固定化された細胞を脱イオン水で洗浄し、窒素ガスで乾燥させた。 AFMイメージング測定は、NanoWizard 3 BioScience AFM (JPK-Bruker)を使用して実行されました。画像は周囲条件下で非接触モード (AC モード) で収集されました。イメージング中、先端にナノメートルサイズのチップを備えた AFM カンチレバー (ACTA モデル、AppNano) がサンプル表面 (X 軸および Y 軸) 上で走査されると振動しました。垂直 (Z) 軸の応答振動振幅は、サンプル表面の振幅画像として記録されました。

C22 ファージ AFM イメージングとナノインデンテーションのために、MES バッファー中の C22 ファージの液滴 100 μL (約 1012 pfu/mL) を各温度 (25、30、35、40 °C) で 30 分間インキュベートしました。インキュベートしたファージ懸濁液の 50 μL 液滴を、AFM 実験の前に 30 分間、APTS 処理雲母基質とともにインキュベートしました。デジタル温度計（421TK、Ponpe Instruments）によってチェックされたAFMサンプルの温度は、加熱ステージ（PetriDish Heater、JPK-Bruker）を使用して各温度で一定に保たれました。 C22 ファージの画像は非接触モード (AC モード) で撮影されました。ファージ粒子の剛性は、AFMの力分光モードで測定されました。 BioLever mini BL-AC40TS-C2 (Olympus) カンチレバーを、熱チューニングによって決定された 0.02 ～ 0.14 N/m のバネ定数で使用しました。簡単に言うと、力-距離 (FD) 曲線は、ファージ粒子の中心領域への AFM チップの押し込みを記録しました。粒子と雲母の FD 曲線の線形領域から抽出された傾きは、ファージ粒子のバネ定数または剛性に対して計算されました (補足図 S3)。計算の詳細は他の場所で説明されています32、45、45、75。

各温度 (25、30、35、40 °C) で、15 ～ 20 個のファージ粒子から 50 ～ 60 の剛性値を測定し、剛性分布を生成しました。 Python76 のオープンソースソフトウェアである正規確率密度関数を使用して、ガウス関数 (正規分布) を経験的剛性分布に当てはめました。ファージの剛性を表すピーク中心と標準偏差 (sd) がフィッティングから抽出されました。次に、標準偏差を剛性の標準誤差 (sem) として計算しました 75,77。原稿内のすべてのプロット図は、Python78 の Mathplotlib ライブラリによって生成されました。

この研究中に生成または分析されたすべてのデータは、この公開された論文とその補足情報ファイルに含まれています。

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この研究は、人材開発、研究、イノベーションのためのプログラム管理ユニットを通じて NSRF から資金援助を受けています (助成番号 B16F640116)。タイ研究基金 (助成金番号 TRG6280009); およびタイ国立科学技術開発庁 (NSTDA) の国立遺伝子工学・バイオテクノロジーセンター (BIOTEC) (プロジェクト番号 P21-51892)。資金提供者は、研究の計画、データの収集、分析、解釈、原稿の執筆、結果の出版の決定において何の役割も果たしていませんでした。

国立遺伝子工学・バイオテクノロジーセンター (BIOTEC)、国立科学技術開発庁 (NSTDA)、パトゥムターニー、12120、タイ

ウドム・セウエン、アンジャナ・ブンチョス、ナムティップ・ピロンリット、オラワン・チャチャワンカンパニッチ、ウボルスリー・リアツサクルパニッチ、ペンチット・チトゥヌスブ

国立ナノテクノロジーセンター (NANOTEC)、国立科学技術開発庁 (NSTDA)、パトゥムターニー、12120、タイ

アロンコットツリートンとチャウィワンサプチャロンクン

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著者全員が実験を考え出しました。 US、AB、NP、AT、CS が実験を実施しました。 US、OC、UL、PC が結果を分析しました。著者全員が原稿をレビューしました。

ウドム・セウエン氏への通信。

著者らは競合する利害関係を宣言していません。

シュプリンガーネイチャーは、発行された地図および所属機関における管轄権の主張に関して中立を保ちます。

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転載と許可

Sae-Ueng, U.、Bhunchoth, A.、Phironrit, N. 他熱応答性 C22 ファージの剛性は、ファージの感染力を調節します。 Sci Rep 12、13001 (2022)。 https://doi.org/10.1038/s41598-022-16795-y

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受信日: 2022 年 4 月 23 日

受理日: 2022 年 7 月 15 日

公開日: 2022 年 7 月 29 日

DOI: https://doi.org/10.1038/s41598-022-16795-y

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